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細胞株的一些篩選事項為您解讀

原載自:www.008580.com[技術資料頻道]  2020-01-14  瀏覽次數(shù):1292

   細胞株的篩選我們要注意加藥時間以及維持濃度:
  1.由于基因轉染到細胞內(nèi)之后要一段時間才能表達出蛋白質。所以細胞株篩選時不能太早;但是也不能太晚,因為轉染了外源基因的細胞代謝負荷較大,增值較慢,時間長了就會被沒有外源基因轉入的細胞所淹沒,終導致篩選不出陽性克隆,一般要在轉染24小時之后才開始加篩選。隨著細胞的代謝,濃度和活性都會下降,所以每3-5天都要更換一次篩選液。
  2.加抗生素的時機,主要是考慮插入到細胞基因組的抗性基因是否已經(jīng)得到表達。一般是轉染48小時后加入抗生素。挑出單克隆后就可以用維持濃度,一般是穩(wěn)定細胞株篩選濃度的1/2。
  關于維持濃度,有人說細胞會出現(xiàn)對抗生素的抗性,應不斷提高其濃度。而且如果要挑選幾個陽性克隆中較高表達的克隆的話,可以調整抗生素的濃度。當然,抗性基因高表達,目的基因不一定就跟著高表達。
  此外,也需穩(wěn)定細胞系構建培養(yǎng)液:
  加藥篩選穩(wěn)定細胞株約6天左右,細胞會大量死亡,孔中只剩下的細胞*。這時會出現(xiàn):
  1.死亡的細胞會裂解釋放出有害物質,導致那些有表達陽性細胞死亡,即非選擇性死亡,因此要及時換液。
  2.孔中細胞數(shù)目很少,細胞之間的信號會變得很弱,也會導致陽性細胞的狀態(tài)不佳甚至死亡。這個時候需要一種特殊的培養(yǎng)液,再轉染后篩選穩(wěn)轉細胞株過程中就可以應用這種培養(yǎng)基。
  3.適當增加血清濃度。

 

 

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